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疾患と関わる血液中の酵素活性異常を「1分子」レベルで見分ける技術の開発 ～酵素の超感度検出による疾患の早期診断法の確立に期待～ 研究成果
大学院薬学系研究科の坂本眞伍大学院生、小松徹特任助教、浦野泰照教授、理化学研究所開拓研究本部渡邉分子生理学研究室の渡邉力也主任研究員、東京大学大学院工学系研究科の野地博行教授、名古屋市立大学大学院薬学系研究科の川口充康講師、中川秀彦教授、国立がん研究センター研究所の本田一文部門長らの研究グループは、血液中の酵素を「1分子」レベルで区別して検出する新たな方法論を開発し、疾患と関わる酵素活性異常を超高感度に検出する病態診断法の可能性を示しました。本研究成果は、2020年3月12日付でScience Advances誌に掲載されました。
発表概要
研究グループは、酵素活性を高感度に検出する有機小分子蛍光プローブ技術と、1分子レベルの高精度計測を可能とするマイクロチップ技術という異なる分野の技術を融合させることで、生体サンプル中の多数の酵素の活性を1分子レベルで網羅的に検出する方法論を世界に先駆けて確立し、 これまでの方法論では検出が困難であった血液中のごく微少量の疾患関連酵素を超高感度に検出することを可能としました。そして、本技術を用いて膵臓がん患者血液中の酵素活性を解析し、疾患の進行に伴い血液中に上昇する新たなバイオマーカー候補タンパク質を発見することに成功しました。今後、本手法を用いて様々な疾患バイオマーカー候補の発見や、これに基づく新たな疾患診断法の確立につながることが強く期待されます。
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図1： 本実験系（Single-molecule enzyme activity-based protein profiling; SEAP）の概念図。（左）マイクロチップ中に1分子ごとに封入される酵素の活性を3色の蛍光プローブによって検出することで、その反応性の違いから含まれる酵素種の違いを見分けることができる。（右）活性に応じて酵素を「数える」方法論の模式図。これによって、疾患時、正常時に異なる酵素活性のパターンを容易に見つけることが可能となる。
図2： （左）開発したALPプローブ群。青色、緑色、赤色の3色の蛍光を示す蛍光物質を基に、異なるリン酸エステル加水分解酵素への反応性を持つ官能基を結合させた。（右）TNAP、ALPIの個別検出。個々の反応容器内に含まれるTNAP、ALPIを、それぞれのプローブとの反応性の違いによって見分けることができた（青色がTNAP、黄色がALPI）。
図3： 人工的に作られた酵素（上）と血清中（下）におけるエステル加水分解酵素（TNAP、ALPI）の1分子レベルの構造的特徴の違い。矢印（→）が単量体、矢頭（▲）が二量体の状態にある酵素に相当し、両者の比率が由来によって大きく異なることが明らかになった。
図4： 糖尿病患者血清中のリン酸エステル加水分解酵素群の1分子活性検出。（左）3色の蛍光プローブを用いた計測におけるマイクロチップの蛍光像。各反応容器の色は3色の蛍光像の重ね合わせ。（右）糖尿病患者の血清における活性の検出。赤枠で囲った部分の酵素の数を数えると、糖尿病患者のグループでALPIに相当する酵素が増えている様子が観察された。
図5： 膵臓がん患者血漿中のENPP活性の1分子活性検出。（左）2色の蛍光プローブを用いた計測におけるマイクロチップの蛍光像。（中央）蛍光プローブの分子構造。（右）膵臓がん患者由来血漿、健常人血漿におけるENPP3活性の違いの検出。
論文情報
Shingo Sakamoto, Toru Komatsu*, Rikiya Watanabe*, Yi Zhang, Taiki Inoue, Mitsuyasu Kawaguchi, Hidehiko Nakagawa, Takaaki Ueno, Takuji Okusaka, Kazufumi Honda, Hiroyuki Noji*, and Yasuteru Urano*, "Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples," Science Advances: 2020年3月11日, doi:10.1126/sciadv.aay0888.
論文へのリンク (掲載誌
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